The Innovation | 突破极限：Hyper-seq助力大数据育种变革

导 读

海南大学的夏志强团队开发了一种低成本、高效、灵活、高通量的DNA测序文库制备和基因分型方法Hyper-seq，大大降低了建库测序的时间和价格成本。该方法可通过使用不同的Hyper-seq引物，灵活地调节标记密度，以低成本满足不同需求，适用于各种物种（包括复杂大基因组）的重测序或简化测序。对于1G基因组样本，Hyper-seq建库测序成本可降低至每个样本10美元以下。Hyper-seq技术于2021年获得国际专利授权（专利号：No.2020/06979），目前已有超过15家研究机构和高校采用该技术，大大提高了作物育种效率。

图1 Hyper-seq方法及其应用领域

A. Hyper-seq文库制备和测序：利用特殊的Hyper-seq引物，仅需一步PCR即可同时完成简化基因组、添加接头序列及扩增基因组序列；B. 根据需要利用不同的Hyper-seq引物灵活微调标记密度；C. Hyper-seq技术的应用领域

粮食安全事关人类生存，其中种子是国家粮食安全的关键。只有用自己的手攥紧中国种子，才能端稳中国饭碗，实现粮食安全。近十年来，基因组辅助育种利用SNP和InDel标记，在分子标记辅助育种和品种培育方面发挥了非常重要的作用。然而对于具有较大基因组的群体，全基因组测序仍然非常昂贵。为促进作物遗传改良，迫切需要低成本、自动化、能根据不同项目需求灵活调节标记密度的高通量测序文库制备方法和操作便捷的测序分析平台。为降低测序成本，促进种业发展，本研究开发了一种具有高成本效益的全新DNA测序文库制备和基因分型方法Hyper-seq（图1）。为了检测该方法的有效性，我们对6个物种的2094份样品进行了建库测序及数据分析。

Hyper-seq方法具有更高的效率和成本优势

与常用的高通量简化测序方法如RAD、GBS、2b-RAD和AFSM等相比，Hyper-seq方法具有更高的效率和更低的成本。由于特殊的引物设计，包括了“粘性模块”和“样本识别模块”，在Hyper-seq测序文库的建库过程中，不需要高质量DNA，甚至可直接使用新鲜叶片仅通过一步PCR扩增，即可同时完成简化基因组、添加接头序列及扩增基因组序列。由于不需要酶切、接头序列连接等常用高通量测序方法必需的费时费力步骤，它的高通量测序文库制备过程得到极大的简化（表1）。Hyper-seq测序库可缩短至3小时，远低于常规高通量测序方法（> 20小时）。完成PCR后，每个样品等量混合，回收纯化250-500bp PCR产物，有效避免了常规测序方法普遍面临的测序数据量较大差异的问题。另外，在不影响构建测序文库的情况下，可通过自动化设备的开发进一步降低成本。

表1 与传统WGS方法时间成本的比较^a

a. 对于384个样本

b. Commonly WGS approaches (2b-RAD, RAD, GBS, AFSM and re-sequencing) are started from DNA extraction.

值得一提的是，由于育种芯片是针对给定的物种有限种群进行开发，只包含一组固定且有限的分子标记。对于非模式物种，育种芯片不仅需要增加开发成本，还需要预先提供参考基因组信息。这些复杂的步骤不仅耗时，也增加了测试成本。而新型Hyper-seq测序方法避免了这些复杂的步骤，极大地简化了测序过程，提高了测序效率，并降低了成本。

表2 利用Hyper-seq检测出的分子标记

¹ Hyper-seq-G

² Hyper-seq-FD

与育种芯片相比，Hyper-seq技术能检测出更多的标记

为减少潜在的连锁阻力，高分辨率分子标记对于精准育种是很有必要的。其中，分子标记数量和覆盖均一性是两个关键指标。在进行育种背景筛选时，有限且不均匀的标记会加强遗传背景效应。本研究在玉米、马铃薯、节节麦、木薯、水稻、小麦中分别获得了5,395,605个、5,086,178个、4,912,506个、2,334,294个、2,586,451个、2,573,078个SNP和InDel标记（表2）。这些SNP和InDel标记在染色体上的覆盖也比较均匀（图2）。由此看出，在分子标记数量和均匀性方面，利用Hyper-seq技术检测出的分子标记数量大大超过育种芯片。

图2 Hyper-seq检测分子标记的基因组覆盖度

Hyper-seq-FD进一步降低测序成本

通常由于不同项目要求，需要不同基因组覆盖程度的测序数据。例如：针对大基因组作物（如小麦）的项目需要进一步降低标记密度，可通过一组Hyper-seq-FD引物扩增来实现，进一步降低了测序成本。

Hyper-seq-INC能获得具更高基因组覆盖度的分子标记

在某些情况下，为获得更高的基因组测序覆盖度的标记，可使用带有不同Hyper-seq-INC引物组合来增加标记密度。本研究利用Hyper-seq-INC中多对引物，可达到不同的基因组覆盖度（1%-55%）。对于木薯单个样本，最高的基因组覆盖度高达278.54 Mb（56.22%），这与我们在木薯中利用重测序得到的基因组覆盖度（67.27%）相当，但建库成本更低，效率更高。

总结与展望

本文提出了一种低成本、高效、灵活、高通量的全新DNA测序文库制备和基因分型方法Hyper-seq。此方法适用于任何物种，仅需一步PCR，即可同时完成简化基因组、添加接头序列及扩增基因组序列。根据具体需要，可使用不同的Hyper-seq引物对标记的密度进行微调。Hyper-seq技术可用于作物遗传背景筛选、遗传图谱构建、DNA指纹图谱构建（专利号：No.102543和No. 202010102817.5）、全基因组关联分析、目标关键基因或新候选基因定位、品种鉴定、基因组选择育种、分子水平检验检疫等领域，具有广阔的应用前景。随着DNA测序成本的进一步降低，以及简捷、快速基因分型平台的开发，Hyper-seq技术将使更多的全球非模式作物育种者受益。

责任编辑

陈朝吉 武汉大学

于伟利 中科院长春光学精密机械与物理研究所

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原文链接：https://www.cell.com/the-innovation/fulltext/S2666-6758(22)00050-9

本文内容来自Cell Press合作期刊The Innovation第三卷第四期以Translational Patent发表的“Hyper-seq: A novel, effective and flexible marker-assisted selection and genotyping approach” (投稿: 2022-01-25；接收: 2022-04-22；在线刊出: 2022-4-29)。

DOI: https://doi.org/10.1016/j.xinn.2022.100254

引用格式：Zou M. and Xia Z. (2022). Hyper-seq: A novel, effective and flexible marker-assisted selection and genotyping approach. The Innovation. 3(4),100254.

作者简介

夏志强，研究员，海南大学三亚南繁研究院“基因组与大数据育种”团队负责人，海南大学热带作物学院副院长、博士生导师。美国加州大学戴维斯分校访问学者，海南省南海青年名家。从事基因组测序，转录水平、高通量技术开发与大数据育种技术方法等研究。开发多组学平台，提供染色体层面上的复杂基因组、甲基化等大数据分析体系。发表世界首个木薯、百香果、象草等精细基因组图谱。针对极复杂基因组完成马铃薯同源四倍体单倍型。原创研发两代超低成本基因型分型技术和表观遗传分析技术。获授权国家发明专利4项，国际发明专利3项，发表SCI论文26篇。两项国家重点研发专题负责人，主持参加国家自然科学基金、地区重点基金等科研项目10余项。

Web: https://hd.hainanu.edu.cn/rdzw/info/1030/2000.htm

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